Etapas envolvidas numa estratégia de clonagem

7 Abril 2020, 14:00 • Maria Luísa Lopes de Castro e Brito

Apresentação das etapas envolvidas numa estratégia de clonagem:

- obtenção dos fragmentos de DNA a clonar,

- construção dos vectores recombinantes,

- introdução dos vectores recombinantes nas células hospedeiras,

- selecção e caracterização dos clones recombinantes.

Hospedeiros de clonagem: procariotas e eucariotas; Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae, outros exemplos.

Vectores de clonagem: características gerais.

Plasmídeos: pUC18 (a-complementação) e pBR322 (genes de resistência a dois antibióticos).

Métodos de transferência de genes em células microbianas:

- transformação e electroporação; competência natural e provocada, eficiência de transformação.

- transdução; ciclo lítico e ciclo lisogénico; utilização de bacteriófagos como vectores de clonagem.

- conjugação triparental; plasmídeos conjugativos (genes tra) e plasmídeos mobilizáveis (genes mob).

Selecção e Rastreio de recombinantes:

- Definições.

- Métodos de selecção e de rastreio: utilização de antibióticos;  inactivação por inserção;

complementação de mutações específicas.